Читаем Агрохимия полностью

Еще в конце прошлого столетия высказывались различные предположения о путях связывания азота. Рассматривали два возможных способа связывания молекулярного азота — окислительный и восстановительный. Крупнейший специалист в области азотного питания растений Д. Н. Прянишников считал переход от N₂ к NH₃ через оксиды азота невозможным и противоречащим принципу допустимой экономии энергии у организмов. Известный русский ученый С. Н. Виноградский в конце прошлого столетия впервые высказал предположение о путях восстановительного связывания молекулярного азота до аммиака. В своей работе «Об усвоении микробами газообразного азота атмосферы» он писал: «Механизм процесса усвоения азота представляется в данном случае как действие водорода в момент его выделения на газообраз-

ный азот в живой протоплазме клетки. Гипотеза о том, что синтез аммиака является непосредственным результатом этого процесса, кажется нам обоснованной». Теорию С. Н. Виноградского о фиксации молекулярного азота через аммиак развивал П. А. Костычев с сотрудниками. В настоящее время восстановительный путь связывания молекулярного азота при различных вариантах промежуточных этапов принят большинством исследователей (рис. 19).

В течение последних лет проводили интенсивные исследования нитрогеназы — основного фермента, осуществляющего процесс азотфиксации. У бобовых культур нитрогеназа находится в клубеньковых бактериях, приобретающих внутри клубенька форму бактероидов. Долгое время изучение биохимической сущности процесса фиксации азота задерживалось из-за невозможности получения содержащих нитрогеназу бесклеточных экстрактов из свободноживущих микроорганизмов и симбионтов, способных фиксировать молекулярный азот.

Выделение активного азотфиксирующего ферментного комплекса — нитрогеназы возможно только при соблюдении анаэробных условий.

Впервые бесклеточные экстракты из клубеньков сои были получены в лаборатории Эванса в 1968 г. Нами в 1970 г. был выделен ферментный комплекс (нитрогеназа) из бактероидов клубеньков люпина и сои. Нитрогеназу разделили на два белковых компонента. Один из них с молекулярной массой 164 000 содержал молибден и железо, а второй имел молекулярную массу 56 000 и содержал только железо. Каждый из этих белковых компонентов отдельно не фиксировал молекулярный азот, но их смесь обладала значительной азотфиксирующей активностью. Бесклеточная азотфиксирую-щая ферментная система из клубеньков бобовых очень похожа на ферментную систему свободноживущих азотфиксаторов.

В настоящее время нитрогеназа выделена из ряда бактерий различных систематических групп и очищена.

У большинства микроорганизмов нитрогеназа инактивируется кислородом, причем Fe-белок более чувствителен к кислороду, чем Мо—Fe-белок. Помимо этого Fe-белок большинства микроорганизмов очень чувствителен к холоду и инактивируется при температуре около О °С. Для реакции восстановления азота необходимо наличие обоих компонентов нитрогеназы, АТФ, источника электронов и ионов Mg²⁺. Процесс биологической фиксации азота сопряжен с гидролизом АТФ, при этом образуются АТФ с ионами магния. Большинство исследователей считают, что на фиксацию 1 молекулы азота затрачивается 15 молекул АТФ.

Характерная особенность нитрогеназы — восстановление не только молекулярного азота, но и других субстратов, обладающих тройными связями. Это позволило широко использовать метод определения азотфиксации по восстановлению ацетилена в этилен.

Всю известную информацию можно объединить в следующую схему, включая ступенчатое восстановление через диимид и гидразин (рис. 20). Биохимия нитрогеназы окончательно неясна до тех пор, пока не будут описаны реакции на молекулярном уровне. Недостаточно изучено, как энергия от гидролиза АТФ сочетается с переносом электронов к нитрогеназе, как происходят комплексование и восстановление молекулы азота, не до конца ясен механизм участия в этом процессе металлов, в том числе молибдена. Потребность в молибдене у фиксирующих атмосферный азот видов азотобактера намного больше, чем у видов, использующих нитраты в качестве источника азота.

В состав симбиотических азотфиксирующих систем помимо фермента нитрогеназы входят и другие металлсодержащие белки бактероидов и тканей клубенька.

Mo Fe

\ /

S

+ Mo Fe —► Мо \ /

S

1,46

2NH.+Mo Fe

\/

S

~MoNH₂H₃NFe

23^NH—NH_2n^ *Мо^“2,9 —4,1—►Fe^-

Рис. 20. Схема ступенчатого восстановления азота через диимид и гидразин

(Харди, 1970)